Mikrobiomos kokybės kontrolė: kaip užtikrinti pakartojamus rezultatus nuo mėginio iki sekoskaitos

Šališkumo problema mikrobiomos tyrimuose

Mikrobiomų tyrimai atveria precedento neturinčias galimybes suprasti sudėtingas mikrobinės bendrijos sąveikas, bet kiekviename žingsnyje jie pažeidžiami šališkumo, nuo mėginio surinkimo iki DNR sekoskaitos ir analizės. Ta pati išmatų mėginio porcija gali duoti priešingas išvadas skirtingose laboratorijose. Vienu atveju dominuoja Bacteroidetes (Gram-neigiamos) (Gram-neigiamos), kitų – Firmicutes (Gramteigiamos). Dažniausia priežastis – lizės šališkumas: jei vienos darbo eigos metodas nepakankamai efektyviai suardo tvirtas Gramteigiamų bakterijų sieneles, jos lieka nepakankamai atstovautos, o „lengvos“ ląstelės išryškėja. Tokie neatitikimai parodo, kodėl griežta kokybės kontrolė (QC) yra būtina, kad suprastume, kur baigiasi biologija ir prasideda techniniai artefaktai. Šališkumas gali atsirasti bet kur: mėginių tvarkyme (per didelis augimas, žuvimas, oksidacija), DNR išskyrime (nevienodas lizavimas), bibliotekoje ir PGR (amplifikaciniai prioritetai), sekoskaitoje ar bioinformatikoje. Tai ne triukšmas, o sisteminės kryptys. Jos pastoviai palankesnės tam tikroms grupėms (dažnai lengviau suardomoms), todėl be kontrolės nėra aišku, ar pokytis yra tikras, ar techninis.

Išsaugokite mėginio vientisumą dar surinkimo vietoje

Rezultatai dažnai „sukuriami ar sugadinami“ dar prieš laboratoriją. Nuo pirmos sekundės mėginys gali keistis: kai kurios bakterijos dauginasi, kitos nyksta, nukleorūgštis ardo fermentai, o deguonis ir temperatūra perstato pusiausvyrą. Jei mėginys nenustabilizuojamas, tranzito metu gali „iššauti“ oportunistai (pvz., E. coli) ir užgožti jautresnius organizmus. Išeitis, stabilizuoti iš karto: konservantai (pvz., DNA/RNA Shield™) „sustabdo laiką“ kontaktuodami su mėginiu, leidžia siųsti kambario temperatūroje ir apsaugo DNR/RNR nuo irimo.

• Venkite pakartotinio užšaldymo ir atšildymo: atšildžius išsiliejęs ląstelių turinys gali toliau ardyti nukleorūgštis, o poveikis nebūtinai vienodas visoms grupėms (kai kurios, pvz., Bacteroidetes (Gram-neigiamos), tampa retesnis).
• Riboti deguonies poveikį ir laiką kambario temperatūroje: Daugelis mikrobų yra deguoniui jautrūs; naudokite anaerobinius rinkinius arba stabilizuokite iš karto.
• Laikykitės švarios grandinės: vienkartiniai įrankiai, sandarūs indai, aiškūs žymėjimai, ir neigiama kontrolė (tuščias mėgintuvėlis per visą procesą) aptikti fonui.

Nepraraskite pavyzdžio dėl laiko.

Išskyrimas ir paruošimas: mažinkite šališkumą ir inhibitorius

Net ir idealiai atvežtas mėginys laboratorijoje gali „sugriūti“ ant DNR išskyrimo. Tai vienas kritiškiausių etapų. Tikslas – lygiai suardyti visus organizmus ir gauti DNR be inhibitorių. Jei metodas „mėgsta“ lengvai lūžtančias Gram neigiamas, o Gram teigiamos lieka neužkliudytos, vaizdas iškryps.

Praktiniai principai

• Robustiška lizė: mechaninis suskaldymas (metant rutuliukus) ir tinkami reagentai atveria ir „kietas“ sieneles; vienodos sąlygos visiems mėginiams.
• Inhibitorių šalinimas: Dirvožemio, išmatų ir panašių mėginių tyrimai gali sukelti PGR inhibitorių poveikį. Rinkitės procedūras, kurios apima inhibitorių šalinimą; „spike-in“ kontrolė padeda diagnozuoti inhibiciją.
• Kontrolė kiekvienoje serijoje: neigiama (fonui) ir teigiama (modelinė bendrija) – nukrypimai rodo bėdas ekstrakcijoje, PGR ar analizėje.
• Bibliotekų paruošimas Patikrinkite pradinius duomenis, ribotą ciklų skaičių (amplikonas); shotgun, PCR-free arba minimalus PGR; stebėkite išeigas ir fragmentų pasiskirstymą.

Naudokite mikrobiomos standartus šališkumui pamatuoti

Net ir ideali praktika turi būti įrodyta. Naudokite standartus kartu su tikrais mėginiais ir palyginkite gautus rezultatus su žinomu įnašu. Tai „ground truth“ kompleksiniame mikrobiome. Standartai būna dviejų tipų: visų ląstelių ir DNR. Kiekvienas atskleidžia skirtingus šališkumus. Visų ląstelių (whole-cell) standartas: intaktų mikroorganizmų mišinys eina per visą procesą ir atskleidžia lizės/ekstrakcijos šališkumą (pvz., Gram neigiamos „išsipučia“, Gram teigiamos „krenta“). DNR (be ląstelių) standartas: Išgryninta DNR iš genomo pradedama bibliotekos paruošimo etape ir testuojama PGR/sekoskaitos/bioinformatikos metodais, eliminuojant DNR ekstrakciją kaip kintamąjį.

Vykdykite abu: jei **whole-cell** skiriasi, o DNR ne, problema yra viršuje (lizė/ekstrakcija). Jei abu skiriasi vienodai, problema yra apačioje (PGR/biblioteka/analizė). Šis dvigubas metodas padeda lokalizuoti problemas.

16S/ITS ar shotgun metagenomika: pasirinkimas pagal tikslą

Dvi dažniausios strategijos: tikslinė amplikono (pvz., 16S bakterijoms, ITS grybams) ir „shotgun“ metagenomika (visos DNR sekoskaita). Svarbiausi mainai:

• Taksonominė raiška. Jei pakanka genties lygmens (neretai – ir rūšies), 16S/ITS gali užtekti. Shotgun dažniau suteikia aukštesnę raišką (iki rūšies ar net kamieno), nes mato visą genomą. Jei reikia kamienų, izoliatų ar labai tikslaus atskyrimo rinkitės shotgun.
• Funkcinis profiliavimas. 16S/ITS pateikia „kas ten yra“, o shotgun leidžia matyti „ką jie gali“, metabolines funkcijas, rezistomą, virulentiškumo genus ir pan. Funkcijai – shotgun.
• Kaina ir duomenų apimtis. 16S/ITS yra žymiai pigiau ir paprasčiau (mažiau duomenų per mėginį), tad didelėms kohortoms tai racionalu. Shotgun brangesnis (didesnis gylis per mėginį), bet duoda „viską“.
• Šeimininko DNR įtaka. 16S/ITS metodu apeinama žmogaus DNR, nes amplifikuojami tik bakterijų/grybų žymenys. Shotgun metodu „matoma viskas“ – šeimininko DNR gali užimti didžiąją dalį skaitymų (ypač mažos biomasės mėginiuose), todėl reikalingas depletyvimas arba didesnės sekoskaitos apimtys. Jei mėginys turtingas šeimininko DNR, 16S/ITS metodas turi praktinį pranašumą.
• Klaidingi teigiami. 16S su klaidų pataisymu (pvz. DADA2) dažnai turi mažą klaidingų teigiamų rodiklį. Shotgun gali sukelti „pseudo organizmus“ dėl priskyrimo klaidų/duomenų bazės ribotumų, reikia griežtesnių bioinformatinių filtrų. Klinikinėms/validavimo užduotims 16S/ITS gali būti patikimesnis „kas tikrai yra“.

Apibendrinant: rinkitės pagal klausimą, mėginio tipą ir biudžetą. Jei reikia funkcijos/raiškos – shotgun. Jei reikia pigiai ir plačiai apžvelgti bendriją ar aplink daug šeimininko DNR – 16S/ITS. Dažnas kompromisas: 16S visai kohortai, o shotgun – tikslinei poaibei.

Esminės žinutės

• Take a sample at the collection site: stabilizuokite iš karto, venkite užšaldymo ir atšildymo, kontroliuokite laiką ir deguonies poveikį, turėkite tuščių mėginių (negatyvų) kontrolei.
• Ekstrakcija skalaukite ir „kietąsias“ ląsteles, pašalinkite inhibitorius, visada naudokite teigiamą ir neigiamą kontrolę.
• Matuokite, o ne spėliokite: Taikykite visų ląstelių ir DNR standartus, kad lokalizuotumėte šališkumą ir užtikrintumėte duomenų integralumą.
• Pasirinkite tinkamą sekos skaičių: 16S/ITS didelio masto analizei ir kai yra daug šeimininko DNR; shotgun sekos analizei raiškai ir funkcijai. Galima derinti.

Reikia pagalbos planuojant mikrobiomos darbo eigą ar pasirinkti standartus? „Nanodiagnostika“ kartu su „Zymo Research“ padės parinkti mėginių ėmimo/stabilizavimo rinkinius, whole-cell ir DNR standartus, DNR išskyrimo sprendimus ir patars dėl 16S/ITS vs. shotgun pasirinkimo. Parašykite, padėsime pradėti švariai ir užbaigti užtikrintai.